Naujas nežmoginių primatų modelis, skirtas išdžiūti streso sukeltai sausų akių ligai

Gyvūnai

Dvylika rezus makakų beždžionių patelių (M. mulatta) šiuose eksperimentuose buvo naudojami nuo 4 iki 5 metų amžiaus. Beždžionės turėjo laisvą prieigą prie geriamojo vandens ir buvo šeriamos beždžionių čiaupu (12% kalorijų iš riebalų, 18% kalorijų iš baltymų ir 70% kalorijų iš angliavandenių; 200–300 g per dieną). Be to, kasdien buvo skiriama vaisių, daržovių arba papildomų papildų ir įvairių žaislų. Visi eksperimentiniai protokolai (AW2038) buvo peržiūrėti ir patvirtinti Sichuan Primed Shines Bio-tech Co., Ltd. institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (IACUC). Šio darbo tikslais nebuvo paaukoti jokie gyvūnai. Šis tyrimas atitiko Helsinkio deklaracijos principus ir Nacionalinio sveikatos instituto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą bei Regos ir oftalmologijos tyrimų asociacijos gaires.

Sausos akies sukėlimas

Beždžionės 36 dienas iš eilės buvo laikomos kontroliuojamos aplinkos patalpoje, kurioje santykinė oro drėgmė (RH) buvo mažesnė nei 15%, oro srautas 12 l/min., ir 21–26 °C temperatūroje. Sausos akys buvo kliniškai įvertintos naudojant ragenos dažymą fluoresceinu 0, 14, 21 ir 36 dieną po sausos akies indukcijos.

Gydymo režimas

Praėjus 21 dienai po sausos akies sukėlimo, kontroliuojamos aplinkos patalpoje esančios beždžionės buvo atsitiktinai suskirstytos į dvi gydymo grupes (n = 6 beždžionės / 12 akių kiekvienoje grupėje): (1) grupė, vartojusi vietinį normalų fiziologinį tirpalą kaip placebą, (2) grupė, gavusi vietinį Pred Forte 1% (Allergan, Inc., JAV). Du lašai normalaus fiziologinio tirpalo ir Pred Forte 1% buvo lokaliai lašinami ant abiejų akių neanestezuotoms beždžionėms tris kartus per dieną 14 dienų (iš viso 42 dozės). Sausos akys buvo kliniškai įvertintos naudojant dažymą fluoresceinu 0, 7 ir 14 gydymo dienomis (0 gydymo diena prilygsta 21 dienai po indukcijos).

Ragenos dažymas fluoresceinu (CFS)

Ragenos dažymas fluoresceinu buvo atliktas 0 (pradinė), 14, 21 ir 36 dienomis po sausos akies sukėlimo ir 0, 7 ir 14 gydymo režimo dienomis. Dešimt mikrolitrų skysto 10% fluoresceino (Alcon Laboratories Inc., JAV) buvo užtepta ant beždžionės apatinės šoninės junginės maišelio, o po 10 minučių ragenos dažymas fluoresceinu buvo ištirtas kobalto mėlyna šviesa naudojant plyšinės lempos biomikroskopą (TOKA). TSL-5, Venžou Raymond Photoelectricity Tech. Co., Ltd., Kinija). Punktinis dažymas buvo įvertintas užmaskuotai, naudojant Nacionalinio akių instituto vertinimo sistemą, suteikiant balus nuo 0 iki 3 kiekvienai iš penkių ragenos sričių.17.

Ašarų plėvelės išsiskyrimo laikas (TFBUT)

Ašarų plėvelės lūžimo laikas buvo matuojamas pagal gaires, nurodytas 2017 m. Tarptautinio sausų akių seminaro (DEWS) ataskaitoje.11. Dešimt mikrolitrų 2% fluoresceino tirpalo be konservantų mikropipete užtepta ant junginės maišelio. Oftalmologas privertė beždžiones sumirksėti tris kartus, kad užtikrintų tinkamą dažų susimaišymą. Laiko intervalas nuo paskutinio visiško mirksėjimo iki pirmosios juodosios ragenos dėmės, rodančios ašarų plėvelės sutrikimą, atsiradimo buvo matuojamas naudojant chronometrą. Fono apšvietimo intensyvumas buvo palaikomas pastovus (kobalto mėlyna šviesa), o integruotas geltonas filtras buvo naudojamas siekiant pagerinti ašarų plėvelės matomumą visoje ragenoje. TFBUT buvo matuojamas tris kartus vienai akiai ir buvo apskaičiuota vidutinė matavimų vertė.

Schirmerio testas

Schirmer I testas po vietinio anestetiko vartojimo buvo atliktas 0 dieną (pradinė vertė) ir 21 dieną po sausos akies indukcijos, kad būtų išmatuotas pagrindinis ašarų sekrecija beždžionėse, kaip aprašyta anksčiau.4. Trumpai tariant, 35 mm Schirmer bandymo juostelė (Eickemeyer, Tuttlingen, Vokietija) buvo įdėta į apatinę junginės fornix ties vidurinio ir šoninio apatinio voko krašto trečdalio sankryžą. Akių vokai buvo švelniai uždaryti, o drėkinimo laipsnis buvo matuojamas atitinkamai po 1 ir 5 min.

Ašarų kolekcija

Beždžionės buvo paguldytos ant stalo gulimoje padėtyje po to, kai jas anestezavo į raumenis suleidus 10 mg/kg ketamino hidrochlorido (Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd., Kinija). Trisdešimt mikrolitrų fosfatiniu buferiniu tirpalu buvo įlašinama į apatinį forniksą, o beždžionės buvo rankiniu būdu priversti mirksėti aštuonis kartus. Iš šoninio kanalo mikropipete buvo surinkta iš viso 25 μL ašarų plovimo. Siekdami sumažinti akių paviršiaus dirginimą, ašarų ploviklį surinkome iškart po panaudojimo. Ašarų plovimas buvo patalpintas į 1,5 ml Eppendorf mėgintuvėlį ir laikomas -80 ° C temperatūroje iki tolesnio tyrimo.

IL-17, IL-2, TNF-α, IFN-γ matavimas

IL-17, IL-2, TNF-α, IFN-γ kiekiui ašarose matuoti buvo naudojami LEGENDplex ™ granulių imunologiniai tyrimai (BioLegend, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, į kiekvieną mėgintuvėlį buvo įpilta 25 μl tirpalo, sudaryto iš ašarų, standartinių, mišrių granulių ir buferinių tirpalų. Tada mėgintuvėlis buvo sukamas 800 aps./min. ir inkubuojamas 2 valandas kambario temperatūroje. Po trijų plovimų, kad būtų pašalinti neprisirišę baltymai, į kiekvieną mėgintuvėlį buvo pridėta 25 μL atitinkamų aptikimo antikūnų. Tada mėgintuvėlis buvo sukamas 800 aps./min. ir inkubuojamas dar valandą kambario temperatūroje. Po trijų plovimų, siekiant pašalinti nesurištus aptikimo antikūnus, mėginiai buvo nuskaityti srauto citometru (Beckman CytoFLEX, JAV) ir analizuojami naudojant LEGENDplex™ V8.0 programinę įrangą (BioLegend, JAV).

Statistinė analizė

Grupės buvo lyginamos poriniais arba neporiniais dviejų imčių t-testais. Visos vertės išreiškiamos kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM). P reikšmė <0,05 buvo laikoma statistiškai reikšminga. Visa statistinė analizė buvo atlikta naudojant Prism 9 programinę įrangą.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.